Адсорбционная хроматография. Жидкостная хроматография

Раздел курса: ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Тема лекции: АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ План лекции: Адсорбенты и требования к ним. Влияние адсорбционных характеристик на время удерживания и форму пика. Преимущества и недостатки адсорбционной хроматографии по сравнению с другими вариантами хроматографического анализа. Тонкослойная хроматография. Метод ВЭЖХ и его возможности. Газоадсорбционная хроматография. 1 Л екция 39б

Адсорбционная хроматография - метод, основанный на многократном перераспределении молекул определяемого компонента (сорбата) между подвижной фазой (элюентом) и поверхностью твердого сорбента вследствие адсорбции и десорбции этих молекул. Если адсорбционные свойства компонентов смеси различны, то при движении элюента через сорбент компоненты разделяются. Метод предложен М.С.Цветом (1903)

Требования к адсорбенту Порошкообразное состояние (размер частиц до 1 мм) Монодисперсность (например, фракция 10-15 мкм) Высокая удельная поверхность (свыше 50 м2/г) Механическая прочность частиц Химическая инертность Термостойкость Наличие активных центров на поверхности

Адсорбенты для жидкостной хроматографии Неорганические Органические целлюлоза и ее производные, крахмал, тефлон, другие синтетические полимеры оксид алюминия, силикагель, алюмосиликаты, графит и сажа, мел, тальк и др. На этих адсорбентах разделяют: Малополярные органические Неорганические и сильнополярные вещества (углеводороды, их органические вещества (соли, амино- галоидопроизводные, углеводы) кислоты, карбоновые кислоты и др.) В качестве элюентов при этом используют: Органические растворители Водные и водно-органические (гексан, хлороформ и др.) растворы, ацетонитрил и др. Соответствующие варианты ЖХ называют: нормально-фазовая обращенно-фазовая хроматография хроматография

Активные центры На поверхности адсорбента одновременно существуют разные активные центры, адсорбирующие из ПФ разные частицы. R R R Предварительная обработка адсорбента (прокаливание, промывка реагентами, радиационная прививка и др.) приводит к доминированию тех или иных центров, то есть к получению адсорбента с заданными свойствами Силанольные группы (кислотные центры) для нормально-фазовой хроматографии Алкильные группы (гидрофобные центры для обращенно-фазовой хроматографии) R = С2, С4, С8, С18, С30

Порядок элюирования в нормально-фазовой хроматографии 3 2 1 < <

Порядок элюирования в обращенно-фазовой хроматографии

Скорости движения компонентов смеси в адсорбционной хроматографии зависят от их коэффициентов адсорбционного распределения (коэффициентов Генри) С а tg α = Г Г = da / dC = f (C,T) При низких С Г = Const, а = Г С w ≈ При Vнф Vпф и Г >> 1: При Г1 = Г2 компоненты выходят из колонки одновременно, не разделяясь

Скорости движения компонентов в адсорбционной хроматографии теоретически не должны зависеть ни от концентрации сорбата, ни от состава пробы. На практике эти положения иногда не выполняются, особенно при высокой концентрации компонентов и вводе большой пробы. Это ведет к ошибочным результатам анализа.

Связь изотермы и формы пика

Преимущества и ограничения адсорбционной хроматографии Возможность работы при высоких температурах и давлениях; возможность направленной модификации свойств адсорбента; селективность адсорбции (вплоть до разделения изотопов и оптических изомеров); проявление дополнительного эффекта – разделение молекул по размерам. Выбор адсорбентов ограничен, а их свойства при повторном приготовлении колонки плохо воспроизводимы и теоретически не предсказуемы; возможность необратимой сорбции и химических превращений компонентов пробы на активных центрах; нелинейность изотерм адсорбции, ведущая к искажению формы пиков и неполному разделению компонентов.

Основные варианты адсорбционной хроматографии Классическая жидкостная хроматография (ЖХ) Тонкослойная жидкостная хроматография (ТСХ) Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, ЖХВД) Газоадсорбционная хроматография (ГАХ)

Тонкослойная хроматография (ТСХ) Метод ТСХ предложен в 1938 г. Измайловым и Шрайбер. Используется для экспрессного полуколичественного и качественного анализа жидкостей (органический синтез, биохимические исследования, криминалистическая экспертиза, контроль качества пищевых продуктов, лекарств и других товаров.

Схема выполнения (А) и результат разделения (Б) двухкомпонентной смеси методом ТСХ свидетели проба

Сорбенты для ТСХ: оксид алюминия, силикагель, мел, целлюлоза, а также композиции этих материалов со связующими (силуфол) Толщина слоя – не более 1 мм. Подвижные фазы: смеси органических растворителей Нередко сорбент заранее пропитывают растворителем 1, а используют в качестве элюента растворитель 2. Это меняет механизм разделения – молекулы Х распределяются между двумя жидкими фазами (не адсорбционная, а распределительная ТСХ).

Требования к подвижной фазе Смачивать сорбент, но не взаимодействовать с ним; Растворять все компоненты пробы (но не одинаково!); Не затруднять детектирование компонентов; Легко и количественно удаляться после разделения; Низкая вязкость, доступность, безвредность.

Проявление хроматограммы в методе ТСХ Опрыскивание пластины раствором реагента (дитизон, нингидрин и др.), обработка парами иода. Спектроскопические методы (УФ, люминесценция). Радиохимические методы Объем пробы должен быть минимальным (около 0,01 мл), чтобы не изменить Rf и правильно опознать компонент.

Индивидуальная характеристика каждого компонента смеси в методе ТСХ – его подвижность Rf Линия старта 0 < Rf < 1 Rf = Lx / L0 Линия финиша Величина Rf зависит от природы сорбата, сорбента и элюента, но от концентрации сорбата и присутствия примесей не зависит.

Метод ТСХ. Двумерная хроматография смеси красителей А — ввод пробы; Б — после обработки первым элюентом; В — после обработки вторым элюентом .

Измерение сигнала в методе ТСХ Визуально - по величине и интенсивности пятен; спектроскопия диффузного отражения; радиометрические методы; экстрагируют компонент из пятна и измеряют аналитический сигнал в полученном экстракте (фотометрия, флуориметрия, кинетические методы и др.) F - mx функция Кубелки-Мунка F

Прибор для ТСХ

Особенности метода ТСХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, ЖХВД, HPLC) Метод ВЭЖХ разработан в 1960-х гг. Ш.Хорватом (США) и, независимо от него, Г.Киркландом (Англия). Используется для качественного и количественного анализа смесей органических веществ в следующих областях: химическая технология и нефтехимия, производство лекарственных препаратов, биохимические исследования и клинический анализ, криминалистическая экспертиза, контроль качества пищевых продуктов, лекарств и др. мониторинг состояния окружающей среды.

1а и 1б - резервуары для разных элюентов, 2 - смеситель для градиентного элюирования, 3 - кран-дозатор, 4 – микроколонка с сорбентом Принципиальная схема хроматографа для ВЭЖХ 1Б 4 проба Детектор 1А 2 Насос 3 элюент Сборник фракций или слив

Колонки для ВЭЖХ Длина колонки – до 25 см, внутренний диаметр – до 5 мм, внешний – 1-2 см. Материал – сталь + стекло. Некоторые колонки выдерживают давление до 1000 атм. Набивка – модифицированный силикагель или оксид алюминия, сферические частицы диаметром 5 – 10 мкм.

Основной тип матриц в ВЭЖХ – силикагель Достоинства Недостатки Отработанная технология синтеза Доступность и относительно низкая цена Большой диапазон свойств Механическая прочность Химическая активность OH-групп на поверхности pH стабильность (2-9) Адсорбированная вода

Один из наиболее распространенных и современных жидкостных хроматографов фирмы Shimadzu

Блочный жидкостной хроматограф Agilent 1100

Детекторы для ВЭЖХ

Хроматограмма апельсинового сока > 50 веществ / < 30 минут / 100 атм

Хроматография при ультравысоких давлениях Колонка: 43 см х 30 мкм Сорбент: 1 мкм Давление: 7100 атм Максимальная эффективность: 625000 теор.тарелок / метр Вес установки ~ 7 тонн

Факторы, улучшающие разрешение пиков в методе ВЭЖХ Правильный выбор неподвижной фазы; однородность сорбента, его сферичность; однородность набивки колонки; увеличение длины колонки; уменьшение внутреннего диаметра колонки; правильный выбор подвижной фазы; использование градиентного элюирования; оптимальная скорость потока элюента; уменьшение объема пробы и массы компонентов.

Неподвижная фаза для разделения стереоизомеров Хиральная хроматография (Разделение стереоизомеров в методе ВЭЖХ)

Разделение оптических изомеров аминокислот (IBLC) (NMC) Column, Mightysil RP-18 (150x4.6 I.D.); mobile phase: methanol-0.01 M Na2HPO4, pH 6.0, gradient elution flow-rate, 0,5 ml/min. Detection: DAD, =340 nm. Peaks: 1=L-Asp, 2=D-Asp, 3=L-Glu, 4=D-Glu, 5=L-Asn, 6=D-Asn, 7=L-Ser, 8=L-Gln, 9=D-Ser, 10=D-Gln, 11=D-His, 12=L-Thr, 13=Gly+L-His, 14=D-Thr, 15=D-Arg, 16=L-Arg, 17= -Ala, 18=L-Ala, 19=L-Tyr+GABA, 20=D-Ala, 21=D-Tyr, 22=L-Met+L-Trp, 23=L-Val, 24=L-Phe, 25=D-Met, 26=D-Trp, 27=D-Val, 28=D-Phe, 29=L-Ile, 30=L-Leu, 31=L-Lys, 32=D-Ile, 33=D-Lys, 34=D-Leu.

Газоадсорбционная хроматография (ГАХ) Метод ГАХ предложен в 1945-1948 гг. Эрикой Кремер (Австрия) Сейчас в основном используется для быстрого анализа атмосферного воздуха и легких газовых смесей (в химической технологии). Определяют O2, N2, CO2, CO, H2S, SОx, NOx CH4. Тем же методом анализируют высококипящие органические жидкости. В остальных случаях возможности метода ГАХ уступают возможностям ГЖХ. Метод ГАХ реализуют на насадочных (набивных), а также на капиллярных колонках (тонкий слой пористого адсорбента фиксируется на внутренних стенках колонки).

Пример разделения газовой смеси методом ГАХ